辅导教案
导学诱思DAOXUEYOUSI
一、大肠杆菌
1．大肠杆菌属于革兰氏________性菌，为________型的肠道杆菌。
2．结构：属于________生物。
3．用途：是在________技术中被广泛采用的工具。
4．与人类的关系：它生活在人类的________中，一般对人________(“有”还是“无”)害。有一些菌株对人体能产生危害，因为它们可以侵蚀________并产生________。任何大肠杆菌如果进入人的________系统，都会对人体产生危害。
答案：1.阴 兼性厌氧
2．原核
3．基因工程
4．肠道 无 肠黏膜 毒素 泌尿
二、细菌的培养和分离
1．细菌的培养：
(1)细菌的繁殖：细菌以________的方式繁殖，分裂速度很快，约________分裂一次。
(2)培养细菌的方法：培养细菌，需要将________________________________________________________________________
转移到________中，一般用________转移带菌的培养物。
(3)用不同培养基培养细菌的差别：
接种后，培养细菌的培养基类型接种方法接种后培养的时间(单位：小时)培养结果
液体培养基接种环直接接种培养8 h后每毫升培养基中有________个细菌
固体培养基用接种环在培养基上用________________________________________________________________________的方式接种(该法还可以用于______)培养10～20 h后一个细菌细胞会繁殖成许多个细菌细胞，这些细胞________________________________________________________________________________，形成____________________________________________________________
2.细菌的分离：
(1)分离的方法与特点：分离细菌有________和________2种。前者方法简单，后者操作复杂，但是______________________________________________________________更易分开。
(2)本实验进行大肠杆菌分离，是用________法，就是在________培养基上进行细菌的________。
答案：1.(1)分裂 20 min (2)已有细菌的培养物 新的培养基 接种环 (3)几亿 划线 分离细菌 紧紧聚集在一起
菌落
2.(1)划线分离法 涂布分离法 单菌落 (2)划线分离
固体平面 划线培养
三、灭菌操作
1．灭菌操作的原因：为了获得________的培养物，其关键是防止外________的入侵污染。因此，在培养微生物时必须进行________操作。
2．无菌操作的条：
(1)首要条是________必须是无菌的；
(2)________必须是无菌的；
(3)________的过程必须是无菌的等。
答案：1.纯净 杂菌 无菌
2．(1)各种器皿 (2)各种培养基 (3)菌转移操作
四、大肠杆菌的培养和分离实验
1．实验目的：
(1)进行大肠杆菌的________，利用________培养基进行细菌培养的操作；
(2)进行大肠杆菌的________，用________培养基进行细菌的________培养；
(3)说明大肠杆菌培养的条和操作要求的原理。
2．实验步骤
(1)灭菌：用________在________压力下对LB液体培养基、LB固体培养基和培养皿进行灭菌________min。
(2)自________向________中转移并分装固体培养基：
待冷却至______左右，将三角锥形瓶中的______培养基，在______上分装至几个______中，制成______培养基。
(3)将大肠杆菌自________转移到________中的________培养基中培养：
将大肠杆菌用________在无菌操作下接种至三角锥形瓶中的________培养基中，在________摇床振荡培养________，完成大肠杆菌的培养。
(4)将菌液在________培养基上进行________分离：
从前一步培养得到的菌液中获取菌种，用________以__________法接种至第二步所制得的__________培养基中，在________℃恒温箱中培养________h后观察菌落。
(5)菌种保存：
在无菌操作下将________用________取出，再用________法接种在________上，________培养________后，________冰箱保存。
3．分离实验的结果及相应结论：
观察中若看到在________的末端出现________，则表明菌已被分离了。
4．大肠杆菌分离的用途：________的通用方法，也是用于________的最简便方法之一。
答案：1.(1)扩增 液体 (2)分离 固体平面 划线
2．(1)高压锅 1 kg 15 (2)三角瓶 培养皿 60 ℃
固体 超净台 培养皿 固体平面 (3)斜面 三角瓶 液体
接种环 液体 37 ℃ 12 h (4)固体平面 划线 接种环
划线 固体平面 37 12～24 (5)单菌落 接种环 划线 斜面 37 ℃ 24 h 4 ℃
3．划线 不连续的单个菌落
4．消除污染杂菌 筛选高表达量菌株
核心解读HEXINJIEDU
1．微生物、细菌与大肠杆菌之间有怎样的关系？
(1)概念内涵：其关系图解见下
(2)结构上：三者都是结构简单，形体微小的生物，但是从细胞角度看其结构是不同的，具体如下：
2．培养大肠杆菌的LB培养基中有各种物质，为什么选择这些物质，这些物质有什么作用呢？
(1)人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出了供其生长繁殖的营养基质——培养基。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有五大营养要素，即水、无机盐、碳(提供碳元素)、氮(提供氮元素)和生长因子(不同的细菌需要的各不相同，有物种差异，它主要补充自身不能合成的或合成能力较弱的，但却是生长繁殖必需的物质)。见下表：
微生物的营养要素定义功能类型化合物类型常用物质
碳凡可构成微生物细胞和代谢产物中碳架的营养物质称为碳构成细胞物质，供给微生物生长发育所需要的能量无机碳(自养型微生物用)无机物CO2、NaHCO3、CaCO3等
有机碳(异养型微生物用)蛋白质、核酸类牛肉膏、蛋白胨、花生粉饼、明胶、氨基酸等
糖类脂质等葡萄糖、蔗糖、淀粉等
氮凡是构成微生物的细胞物质或代谢产物中氮素的营养物质称为氮主要是提供合成原生质和细胞其他结构的原料，一般不作能无机氮铵盐NH3、(NH4)2SO4
硝酸盐NO3
N2空气
有机氮牛肉膏、蛋白胨、醇母膏、尿素、明胶等
生长因子一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮自行合成的所需极微量的有机物一般是酶和核酸的组成成分酵母膏、玉米浆、黄豆饼粉、动植物组织液、麦芽汁等，复合维生素
水作用：组成成分；反应介质；物质运输媒体；热的良导体
无机盐作用：维持渗透压、pH等
(2)大肠杆菌的LB培养基
微生物的营养要素本实验中大肠杆菌LB培养基配方培养基配方与微生物营养要素的对应关系
LB液体培养基LB固体培养基
氮、
碳、
无机盐、
生长因子、
水
琼脂1 g
蛋白胨0.5 g主要提供大肠杆菌的氮、碳需求
酵母提取物0.25 g主要提供生长因子
NaCl 0.5 g提供无机盐
水 50 mL提供水
(3)此外配方中还要注意pH等。
3．该实验中这些操作的原因
(1)三角锥形瓶中的LB固体培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才用转移和分装，制成固体平面培养基，为什么？你用什么简易方法快速估计该温度？
因为三角锥形瓶中的LB固体培养基中有琼脂，它在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，当冷却到60 ℃左右时，不会因温度过高烫手而不易操作；也不会因为温度过低而使三角锥形瓶中的培养基凝固，最终无法转移分装制成新的平面培养基。
简易估计温度的方法：可以用手触摸灭菌后的三角锥形瓶，感觉锥形瓶由烫手转为刚刚不烫手时，则说明已经冷却到60 ℃左右了。
(2)进行恒温培养时，为什么要将培养皿倒置？
恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖子上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的，培养皿中的菌落还有可能被盖子上掉落的水给污染。
(3)将大肠杆菌用接种环自斜面转移到液体培养基中培养时，为什么接种环必须先深入到斜面冷却后，才能再取斜面上的菌体？
接种环在取菌体前曾在酒精灯火焰上灼烧灭菌，一直灼烧至红，温度很高，若不冷却就直接用其取斜面上的菌体，菌体可能因为接触高温接种环而死亡，导致大肠杆菌的转移培养失败。
(4)用划线法分离大肠杆菌中，第一次和随后的几次划线前都要灼烧接种环，它们的原因一样吗？在划线结束后仍然要灼烧接种环这又是为什么呢？
虽然每次灼烧都是为了灭菌，但所灭的菌种和原因却不一样。
灼烧接种环的时间消灭的菌体原因
第一次划线前其他杂菌防止其他杂菌的侵入而造成污染
随后的几次划线前上次划线结束后残留在接种环上的实验菌(本实验为：大肠杆菌)为了使下一次划线时，接种环上的菌自上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，最终获得单个菌落，实现菌的分离
最后一次划线结束后为了防止实验菌残留于接种环而污染环境和感染实验人员
(5)用划线法分离大肠杆菌时，每次的划线是怎么样的？对随后的划线的起点有什么要求？为什么这样要求呢？
每一次的划线依次的2次划线之间的关系各次划线的分布
图形辅助理解
划线的要求不能出现线条的重叠第二次以及随后的划线操作，总是从上一次划线的末端开始不要将最后一区的划线与第一区相连
这样要求的原因使线条末端细菌的数目比线条起始处要少因为划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到有单个细菌繁殖而的单菌落若相连，则可能最后一次划线末端处的细菌与第一次的叠加，细菌的数目不是最少的，不能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终将很难获得单菌落
4．消毒与灭菌一样吗？
概念常用方法应用的范围
消毒使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min一般物品
巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min对于一些不耐高温的液体，如牛奶
化学药剂消毒法如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水等
灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)灼烧灭菌：酒精灯火焰接种工具的灭菌
干热灭菌：160～170 ℃下灭菌1～2 h玻璃器皿、金属工具的灭菌
高压蒸汽灭菌：121 ℃条下，灭菌15～30 min培养基及容器的灭菌
5.本实验中还需要了解哪些基础知识才更便于掌握和理解呢？
(1)牛肉膏蛋白胨的知识
牛肉膏和蛋白胨于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
1 000 mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
培养基组分提供的主要营养
牛肉膏 5 g碳、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10 g氮和维生素
NaCl 5 g无机盐
H2O 定容至1 000 mL氢元素、氧元素
(2)巴氏消毒法的知识
巴氏消毒法也称做低温消毒法。
日常生活中经常用到煮沸消毒法。在100 ℃煮沸 5～6 min 可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则使用巴氏消毒法，在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。
题例领悟TILILINGWU
【例题1】 下列操作属于灭菌的是( )
A．用酒精擦拭实验人员的双手
B．用氯气处理水
C．将接种环在酒精灯火焰上灼烧至红
D．杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物
解析：此题考查对微生物实验中灭菌的理解。对微生物培养说，灭菌操作十分重要，其目的就是为了获得纯净的培养物，其关键是防止外一切杂菌的入侵，不仅仅是对人体有害的微生物。灭菌操作一般使用强烈的物化因素(如：灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌等)。而不是使用较为温和的物化方法。
答案：C
消毒与灭菌是不同的。两者除了在物化手段上是否强烈外，所消灭的微生物内容也是不同的。灭菌是消除一切杂菌，而消毒仅仅杀死对人体有害的微生物。消毒往往无法消灭微生物的芽孢和孢子。
【例题2】 下列关于平板划线的操作及叙述，正确的是 …
( )
A．灼烧接种环之后，为避免其他杂菌的干扰，应立即伸入菌液取菌种
B．划线结束后，为避免实验菌污染环境和感染操作者，所以必须再次灼烧接种环
C．在第一次划线前灼烧接种环和每次划线前灼烧接种环的目的相同
D．划线时最后一区域一定要与第一区域相连，达到首尾相接
解析：此题考查对划线法分离大肠杆菌的掌握。这是本实验的一大重点和难点。A的操作是错误的，灼烧接种环之后，要冷却后方能取菌种，以免温度太高杀死菌种。B的操作完全正确。C的叙述是错误的，它们的灼烧目的完全不同，第一次划线前的灼烧是为了杀死其他杂菌，保证实验菌的纯净，而随后的灼烧却是为了杀死残留于接种环上的实验菌，保证实验菌随划线次数的增加而减少，每次划线的菌种自上一次划线的末端。D的操作也是不正确的，不应该相连，这样才能使最后一次划线不受第一次划线的干扰。
答案：B
大肠杆菌的分离所采用的就是划线分离法。这一方法十分重要。我们不仅要知其每一步具体的操作，还要知其所以然，还要关注注意事项，避免踏入误区。
随堂训练SUITANGXUNLIAN
1细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
A．接种针、手、培养基 B．高压锅、手、接种针
C．培养基、手、接种针 D．接种针、手、高压锅
答案：C 解析：灭菌是微生物培养过程中的重要环节。其中高压蒸汽是为了杀灭培养基中的杂菌；酒精擦拭双手，是灭手上的杂菌；而接种针在火焰上灼烧，就是为了灭接种针上的菌。故C选项是正确的。
2下列关于倒平板的操作姿势的叙述中，正确的是( )
A．右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶封口膜
B．右手大拇指、食指拿着三角瓶
C．左手拿着培养皿，盖子放于桌子上
D．倒平板时，为防止温度过高，暂时熄灭酒精灯
答案：A 解析：倒平板技术是微生物技术中的基本技术。只有A是正确的。B中手指姿势错误。C错在培养皿盖放在桌上了。D中熄灭酒精灯不对，整个过程都需在酒精灯火焰旁完成。
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