一、知识归纳
1．与DNA分子相关的酶
名称
作用
参与的生理过程应用
限制性核酸内切酶
切割某种特定的脱氧核苷酸序列
基因工程
DNA连接酶
连接两个DNA片段
基因工程
DNA聚合酶
在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧酸
DNA复制
RNA聚合酶
在核苷酸链上添加单个核糖核苷酸
转录
解旋酶
使碱基间氢键断裂
DNA复制及转录
逆转录酶
以RNA为模板合成DNA
逆转录及基因工程
特别注意：
（1）限制性核酸内切酶的来源：多数来自原核生物；作用特点：主要切割外源DNA，对自身的DNA不起作用从而达到保护自身的目的；作用结果：形成DNA片断末端。
（2）各种酶都具有专一性，特别是限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的碱基之间切开。
2．基因工程的基本操作程序
（1）获取目的基因
①基因文库：是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
②基因组文库：基因文库中含有一种生物所有的基因就叫做基因组文库。
③部分基因文库：含有一种生物的部分基因，就叫做部分基因文库，如cDNA文库。
PCR技术与DNA复制的比较
比较项目
PCR技术
DNA复制
相同点
原理
DNA双链复制（（碱基互补配对）
原料
四种游离的脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶等
不同点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
主要在细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）
细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
（2）基因表达载体的构建（基因工程的核心）
①构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
②一个基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
③构建方法
（3）将目的基因导入受体细胞—转化
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2+处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
特别注意：受体细胞中常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物──大肠杆菌、酵母菌等，但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必需用真核生物酵母菌──需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟红细胞，原因是它无细胞核和众多的细胞器，不能合成蛋白质。
（4）目的基因的检测与鉴定
3．基因工程和蛋白质工程比较
比较项目
基因工程
蛋白质工程
原理
基因重组
中心法则的逆转
区别
过程
获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质
实质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要的生物类型或生物产品（基因的异体表达）
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
结果
生产自然界中已经有的蛋白质
生产自然界中没有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质必须通过基因修饰或基因合成来实现
二、相关试题
1．下列关于基因工程的叙述，错误的是 （ ）
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
2．下表有关基因表达的选项中，不可能的是 （ ）
基因
表达的的细胞
表达产物
A
细菌抗虫蛋白基因
抗虫棉叶肉细胞
细菌抗虫蛋白
B
人酪氨酸酶基因
正常人皮肤细胞
人酪氨酸酶
C
动物胰岛素基因
大肠杆菌工程菌细胞
动物胰岛素
D
兔血红蛋白基因
兔成熟红细胞
兔血红蛋白
3．下列叙述符合基因工程概念的是 （ ）
A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因
B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
4．甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是 （ ）
A．甲方法可建立该细菌的基因组文库
B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库
C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料
D．乙方法需要逆转录酶参与
5．科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色莱航鸡的受精卵DNA中，发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋，而且用这些鸡蛋孵出的雌鸡，仍能产出含该药物蛋白的鸡蛋。下列有关叙述正确的是 （ ）
A．表达载体的导入运用了显微注射技术
B．受精卵的发育需要运用胚胎移植技术
C．这种变异属于不定向的变异
D．这种变异来源于染色体变异
6．科学家在某种农杆菌中找到了抗枯萎的基因，并以质粒为运载体，采用转基因方法培育出了抗枯萎病的金花茶新品种。下列有关说法正确的是 （ ）
A．质粒是最常用的运载体之一，质粒的存在与否对宿主细胞生存有决定性的作用
B．通过该方法获得的抗枯萎病金花茶，将来产生的花粉中不一定含有抗病基因
C．该种抗枯萎病基因之所以能在金花茶细胞中表达，是因为两者的DNA结构相同
D．为保证金花茶植株抗枯萎病，只能以受精卵细胞作为基因工程的受体细胞
7．（双选）下列关于限制酶的说法，错误的是 （ ）
A．限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布
B．自然界中限制酶的天然作用是用来提取目的基因
C．不同的限制酶切割DNA的切点不同
D．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
8．（双选）科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并以质粒为运载体，采用转基因方法培育出了抗枯萎病的金茶花新品种。下列有关说法正确的是
A．质粒是最常用的运载体之一，不需人工改造就可直接应用于基因工程
B．在培养过程中需要采用PCR技术
C．检测抗枯萎病的基因是否翻译出蛋白质，可采用抗病实验
D．为了保证金茶花植株抗枯萎病，只能以受精卵细胞作为基因工程的受体细胞
9．请分析回答下列有关现代生物科技方面的问题：
（1）糖尿病在现代社会中的发病率越来越高，主要是由于患者胰岛B细胞受损，胰岛素分泌不足引起的。对此，某同学根据所学知识提出了用转基因动物生产胰岛素治疗方法。基本程序：①获取目的基因→②基因表达载体的构建→③将目的基因导入受体细胞→④目的基因的检测与鉴定。其中①和②的操作中需要相同的工具酶是 ，该酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定 ，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断裂，暴露出相同的黏性末端。利用PCR技术扩增目的基因的过程中，目的基因受热形成单链并与引物结合，在 的作用下延伸形成DNA。
（2）蛋白质工程的基本途径是：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸的序列→找到相对应的 序列。
10．1957年，生物学家了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，这种因子能作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素；从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。
（1）若已知干扰素的氨基酸序列，则获取目的基因的较简单方法是 ；目的基因还可以从 文库获取，而从cDNA文库中不一定能得到，原因是 。
（2）用限制酶处理质粒和目的基因后，用 酶处理，可形成基因表达载体，该载体的化学本质是 ；基因表达载体除含有干扰素基因外，还必须有 、 和________等。
（3）若选择大肠杆菌作为受体细胞，常用的转化方法是用 处理，使其成为 ，并在一定温度作用下完成 。
（4）转基因技术是否成功，需要对受体细胞进行分子水平的检测，首先是检测受体细胞 上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。检测方法是采用 。最后还要检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，利用的技术是 。
11．正常蚕豆、豌豆和水稻均为二倍体，它们体细胞中的染色体数依次为12、14、24，这三种植物常作为生物学研究的实验材料。
（1）培育多倍体要用到秋水仙素，为观察其作用，最好采用上述三种材料中的 作为实验材料，原因是 。
（2）用32P标记蚕豆体细胞（含12条染色体）的DNA双链，再将这些细胞转入不含32P的培养基中培养，在第二次细胞分裂的后期，一个细胞中被32P标记的染色体条数和未被标记的染色体条数比为 。
（3）正常的豌豆种子缺乏糯性。有人做了实验：选取健壮开花的豌豆进行人工除雄授予糯性水稻的花粉，结果没有获取正常的豌豆种子，你认为最可能的原因是 。
（4）为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。
据图回答：
①图中基因组文库 （填“小于”、“等于”或“大于”）cDNA文库。②B过程需要的酶是 ；A、C过程中 （填“可以”或“不可以”）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。③目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中 和 为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是 。
（5）生产上常将转基因作物与非转基因作物混合种植，其目的是降低害虫种群中的 基因频率的增长速率。
12．2009年10月，我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号”获得农业部颁发的安全证书。下图表示该抗虫水稻主要培育流程，据图回答：
（1）④过程应用的主要生物技术是 。
（2）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析：
①人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入 。
②人工改造时用限制酶Ⅱ处理，其目的是：第一，去除质粒上的 基因，保证T－DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于 。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。
③若用限制酶Ⅰ分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是在含 能够生长，而在含 中能生长。
三、答案及解析
1． D 解析：基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性。载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。所以D错误。
2．D 解析：细菌抗虫蛋白基因可通过转基因技术转入棉花体内，在棉花的叶肉细胞中表达产生细菌抗虫蛋白，使棉花具有抗虫能力；人酪氨酸酶基因可在正常人的皮肤细胞中表达产生酪氨酸酶，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素；动物胰岛素基因可通过转基因技术转移到大肠杆菌体内，在大肠杆菌工程菌细胞中合成动物胰岛素；兔属于哺乳动物，其成熟的红细胞中没有细胞核和众多细胞器，所以不可能表达出血红蛋白。
3． B 解析：基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。所以B为基因工程，而A为动物细胞工程，C为诱变育种，D无人为因素不属于基因工程。
4．C 解析：首先要知道甲图描述的为该细菌的基因组文库，只要利用DNA限制性核酸内切酶将其原有的DNA切断即可，不需要以脱氧核苷酸为原料。乙图描述的为细菌的部分基因文库。乙方法需要逆转录酶参与，并需要以脱氧核苷酸为原料。
5．A解析：本题考查将目的基因导入受体细胞的方法及基因工程的实质。将基因表达载体导入动物细胞（受精卵）的方法是显微注射法，运用显微注射技术；注射了目的基因的受精卵要移植到雌性动物的输卵管或子宫内发育，移植的是受精卵不是胚胎，因此不需要胚胎移植技术；这种变异属于定向变异；这种变异来源于基因重组。
6．B解析：质粒在宿主细胞中能够友好借居，但是不能对宿主细胞的生存起决定作用。由于在转基因植物体内基因只存在于某一染色体上，所以在减数分裂形成配子时随着同源染色体的分离，部分配子存在目的基因，而另外一半配子不含目的基因。抗枯萎病基因之所以能在金花茶细胞中表达，是因为两者共用一套密码子。转基因植物的受体细胞可以是受精卵，也可以是其他体细胞。
7．AB 解析：限制酶主要存在于各种微生物中，而高等生物中则很少。自然界中的限制酶主要用来切割外来的DNA，进行自我保护。
8．BC 解析：基因工程中使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过人工改造的。检测抗枯萎病的基因是否翻译出蛋白质，需要做抗病实验。作为基因工程的受体细胞可以是受精卵，也可以是植物体细胞。
9．（1）限制性核酸内切酶（或限制酶） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA聚合酶（2）脱氧核苷酸
解析：①和②的操作中都需要用到同一种限制酶；限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。DNA模板与引物结合后，在DNA聚合酶的作用下，温度控制在72°C左右，以四种脱氧核苷酸为原料，以靶序列为模板，按碱基互补配对的方式和半保留复制的原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA）。
10．（1）人工合成法 基因组 cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的（其他合理答案也可）（2）DNA连接 DNA 启动子 终止子 标记基因 （3）Ca2+ 感受态细胞 转化 （4）染色体DNA DNA分子杂交技术 抗原—抗体杂交技术
解析：（1）若已知干扰素的氨基酸序列，则可以通过逆转录法获得目的基因；cDNA文库是部分基因文库，因为cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的，因此目的基因可以从基因组文库中获取。（2）用限制酶处理载体和目的基因后，将目的基因与载体连接，需要使用DNA连接酶处理，基因与载体的化学本质是相同的，都是DNA；干扰素基因是目的基因，此外，载体还要有启动子、终止子、标记基因等。（3）目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。（4）检测目的基因使用DNA分子杂交技术；检测蛋白质采用的是抗原—抗体杂交技术。
11．（1）蚕豆 蚕豆体细胞中染色体数目少，便于观察（2）1：1（3）生殖隔离（4）①大于 ②逆转录酶 可以 ③DNA cDNA 耐高温 （5）抗性
解析：该题考查秋水仙素诱导细胞中染色体加倍、DNA半保留复制、豌豆的人工杂交实验、基因工程的工具及步骤。蚕豆体细胞中染色体数目少，染色体比较大，容易观察染色体变异情况。豌豆与水稻属于不同物种，两个物种间存在生殖隔离，存在授粉隔离。基因组文库大于部分基因文库。B是逆转录过程，该过程需要逆转录酶参与催化。PCR技术扩增DNA需要耐热的DNA聚合酶参与催化。本题难度中等。
12．（1）植物组织培养 （2）①启动子 ②tet和tmr 目的基因（或外源DNA）准确插入 ③卡那霉素的培养基 四环素的培养基
解析：（1）④过程表示植物细胞组织培养成植物体。（2）①基因表达载体应含有启动子、终止子、目的基因、标记基因。②从图看出限制酶Ⅱ能破坏tet和tmr。③由图看出限制酶Ⅱ已将四环素抗性基因破坏。
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